провести видовой мониторинг и выбрать виды мышевидных грызунов, численность которых позволяет проводить статистически значимые исследования;

провести анализ показателей крови грызунов, взятых из природных экосистем с различным уровнем антропогенных нагрузок;

провести сравнительный анализ иммунологического статуса мышевидных грызунов тех же районов;

провести оценку относительных частот доминантных леталей у грызунов в районах сравнения;

определить частоты хромосомных аберраций в соматических клетках костного мозга грызунов;

проанализировать относительные частоты встречаемости патологических изменений внутренних органов и злокачественных новообразований в популяциях грызунов сравниваемых районов.

Таким образом, была предложена комплексная биологическая тест-система с использованием важнейших гематологических, цитогенетических, гистологических и онкологических параметров жизнедеятельности мышевидных грызунов в трех районах Алтайского края, имеющих различный уровень антропогенных нагрузок.

В статье кратко представлены результаты биомониторинга природных популяций мышевидных грызунов (Microtinae и Cricetidae), отловленных в Локтевском (окрестности с. Новенское), Тюменцевском (с. Ключи), Угловском (с. Топольное) районах Алтайского края в полевой сезон 1993 г. Участки отлова различались по уровню антропогенных загрязнений. Угловский и Локтевский районы расположены в зоне прохождения радиоактивных облаков после наземных ядерных взрывов на Семипалатинском полигоне в период 1949–1962 гг. (Киселев и др., 1994). Интенсивность загрязнения Локтевского района в настоящее время (1993 г.) менее 50 mCi/км²., Тюменцевского – 50–100 mCi/км², Угловского – 50–130 mCi/км² (Сухоруков и др., 1995). Первичная видовая принадлежность определялась по общему экстерьеру и по зубам после забоя. Окончательную видовую принадлежность определяли по краниологическим параметрам очищенных черепов в лабораторных условиях.

В связи с диагностической и прогностической ценностью изучения общих морфологических показателей крови у отловленных животных проводили измерения гематологических параметров – подсчет числа эритроцитов и лейкоцитов крови. Кроме того, исследовали сыворотку крови для определения уровня содержания иммуноглобулинов класса IgG в условиях стационара.

Исследовали также относительные частоты доминантных леталей, подсчитывая число резорбций эмбрионов у беременных самок.

Проводили также подсчет числа хромосомных аберраций в поздних анафазах и ранних телофазах в клетках костного мозга.

В анафазах митоза регистрировали хромосомные и хроматидные мосты и фрагменты хромосом. У каждого животного анализировали в среднем по 250–300 анафазных пластинок.

Для выявления патологических изменений внутренних органов и злокачественных новообразований у мышевидных грызунов проведено тотальное патоморфологическое исследование органов отловленных животных. Каждое забитое животное взвешивали, вскрывали, производили макроскопическое исследование внутренних органов, определяли массу сердца, печени, почек, селезенки с целью выявления возможных мио- и кардиопатий, а также злокачественных новообразований.

Зоологическая характеристика видов

В рамках поставленных задач выбор видов животных для изучения статистически достоверных показателей должен был отвечать ряду требований: приблизительно равномерной встречаемости как в разнообразных природных биотопах, так и в окультуренных ландшафтах и вблизи населенных пунктов. Этим требованиям наиболее удовлетворяли мышевидные грызуны – мыши и полевки (Mus, Apodemus, Clethrionomys, Microtus).

В ходе экспедиционных работ было отловлено 638 животных, в частности 195 особей Mus musculus и 255 особей Apodemus sylvaticus, что и определило выбор именно этих видов для детального исследования.

Характеристики морфологических показателей крови у отловленных видов грызунов

Эта часть работы выполнена группой к.б.н. В.П.Николина, к.б.н. Н.А.Поповой и сотрудниками.

Из данных литературы известно, что среднее число эритроцитов в периферической крови лабораторных мышей в норме колеблется в пределах 8–10 млн/мм³, среднее число лейкоцитов в пределах 7–15 тыс/мм³ (Лабораторные животные, 1983).

В сравнении содержания форменных элементов крови мы применили дифференцированный подход: 1) анализ крови проводили у мышей без видимых признаков какого-либо патологического процесса; 2) с воспалительными процессами любой этиологии (пневмонии, нагноения и пр.); 3) с паразитарными инвазиями. У здоровых животных Apodemus sylvaticus при сравнительном анализе по трем исследованным районам не выявлено отклонений от нормы количества эритроцитов (7,1·10⁶–7,7·10⁶). Однако у Mus musculus Локтевского района отмечено достоверное снижение количества эритроцитов (5,0± 0,50) по сравнению с Угловским (7,17± 0,40) и Тюменцевским (7,11± 0,52) районами, хотя в последних содержание эритроцитов также находится на очень низком уровне. В содержании лейкоцитов крови существенных различий у здоровых особей домовой мыши из разных районов не наблюдается (6,0·10³–8,3·10³).

Обращает на себя внимание тот факт, что во всех трех районах как у домовых, так и у лесных мышей обнаружено отсутствие реакция белой крови на воспалительные процессы – не наблюдается лейкоцитоза. Более того, в Угловском районе количество лейкоцитов у мышей обоих видов с воспалительными процессами достоверно снижено, 2,9·10³ по сравнению со здоровыми животными (4,8·10³–8,4·10³).

Существенных изменений со стороны форменных элементов крови при паразитарных инвазиях нами не отмечено.

При сравнительном исследовании иммунологического статуса животных обнаружено достоверное снижение уровня IgG у обоих видов мышей Локтевского района. Результаты определения титра антисальмонеллезных антител не выявили достоверных различий среди грызунов в изученных районах сравнения (табл. 1).

Таблица 1. Количество IgG и титры антител против Salmonella dublin в сыворотке крови мышей M. musculus и A. sylvaticus из трёх районов Алтайского края

M.m. – домовая мышь, A.s. – лесная мышь, N – число проанализированных животных.

* Включены животные без каких-либо патологических изменений.

При оценке доли резорбированных эмбрионов у беременных самок Apodemus sylvaticus статистически значимых различий в сравниваемых районах нами не обнаружено. Так как в период отлова Mus musculus в с. Новенском Локтевского района проводили дератизацию грызунов, а по другим районам точных сведений о дератизации нами не выявлено, данные по относительным частотам доминантных леталей у Mus musculus ценности не представляли.

Учитывая полное отсутствие данных о других исследованиях отдаленных последствий ядерных испытаний и других антропогенных воздействий, необходимо подчеркнуть важность сравнительных характеристик по районам. Снижение содержания эритроцитов у домовой мыши, в Локтевском районе в частности, указывает на патологию неясной этиологии, однако точная интерпретация отмеченного достоверного факта требует углубленного анализа вопроса.

Характеристика хромосомных аберраций

Эта часть работы проведена д.б.н. Г.М.Роничевской с сотрудниками.

В таблице 2 представлены данные относительных частот хромосомных перестроек в клетках костного мозга домовых и лесных мышей. Из таблицы 2 видно, что средние частоты перестроек хромосом у животных в Тюменцевском и Локтевском районах почти одинаковы – около 7,5%, однако частоты хромосомных аберраций клеток костного мозга мышей из Угловского района оказались более чем в два раза выше.

Таблица 2. Частота хромосомных перестроек в клетках костного мозга лесных и домовых мышей в различных районах Алтайского края, различающихся по уровню антропогенных загрязнений

Полученные данные указывают на то, что подсчет хромосомных аберраций может достоверно отражать воздействие радиоактивности, в 2–3 раза превышающее фон в этой местности. Этот факт, учитывая большое количество обследованных животных, весьма важен. Следует, однако, учитывать, что на мутабильность может влиять не только повышенный радиоактивный фон, но и химические факторы. Хотя все три исследованных района являются сельскохозяйственными и уровень антропогенного химического воздействия в них может быть приблизительно равным (удобрения, ядохимикаты и прочее), исключить влияние, например, промышленности в Локтевском районе нельзя (геохимическая провинция пос. Горняк).

Исследование патологических изменений и онкологических характеристик внутренних органов у изученных видов грызунов

Д.м.н. Л.А.Семеновой, к.б.н. В.И.Дерибас и сотрудниками был проведен тотальный патоморфологический анализ внутренних органов мышевидных грызунов. Обследовано 217 животных обоего пола: из Угловского района – 87, Тюменцевского – 70, Локтевского – 60 (табл. 3).

В печени животных выявлены паразитарные цисты, пустые или заполненные остатками внедрившегося паразита (в основном эхинококка), и четко отграниченные от ткани органа соединительнотканной капсулой. Кроме того, в легких многих животных наблюдались воспалительные поражения: от слабо выраженного очага уплотнения (воспалительного инфильтрата) хронической интерстициальной пневмонии до тотальной острой пневмонии с участками ателектаза – уплотнения ткани легкого до уничтожения просветов альвеол и деструкции воспалительных инфильтратов тканей легкого (табл. 3).

Таблица 3. Сводная таблица основных патологий внутренних органов грызунов в районах сравнения

M.m. – Mus musculus, A.s. – Apodemus sylvaticus, S – количество патологий у всех видов животных, включая Microtus, Clethrionomys и т.д.

Относительные частоты патологических изменений внутренних органов в районах сравнения оказались различными. В Угловском районе это составляет 97,5%, в Локтевском районе – 87%, в Тюменцевском – 67,2%.

Злокачественные новообразования выявлены у 37 животных: в Локтевском – 9, Тюменцевском – 17, Угловском районе – 11 (табл. 4). Необходимо отметить, что бесспорные (по морфологическим признакам) злокачественные новообразования найдены в печени и в легких (табл. 4). Что касается почек, то в этом органе из 23 выявленных “опухолевых образований” только 5 (у одного животного аденокарцинома, а у четырех – мелкоклеточный рак) расцениваются нами как типичные злокачественные новообразования. У остальных 18 это мелкоочаговые диссеменированные новообразования, состоящие из мелких недифференцированных мононуклеарных клеток, среди которых рассеяны крупные пенистые клетки с дегенеративными ядрами. Этот тип опухоли был обозначен нами как сходный с ним смешанный светлоклеточный рак почки.

В селезенке некоторых животных обнаружены скопления мелких лимфоидных клеток в красной пульпе, характерных для лейкемии.

Относительные частоты встречаемости злокачественных новообразований в сравниваемых районах достоверно не различаются, однако спектр новообразований в Тюменцевском районе оказался наиболее широким (табл. 4).

Таблица 4. Типы злокачественных новообразований (по гистологическим признакам)

Кроме описанных изменений, у ряда животных в печени, почках и легких определяются очаги скопления мононуклеарных овальных клеточных элементов. Во всех обследованных органах эти очаги гиперплазии по составу клеточных элементов и картине распределения сходны между собой. Клетки этих новообразований абсолютно не сходны с паренхиматозными и соединительнотканными клеточными элементами нормального органа. Эти гиперпластические очаги распределяются в исследованных органах или в виде четко отграниченных от окружающей ткани узлов, или в виде инфильтратов без четких границ, пролиферирующих между клетками здоровых тканей. Узелки не имеют выраженной капсулы, а границы, отделяющие их от нормальной ткани, представлены уплотнением последней.

Аналогичные очаги гиперплазии во внутренних органах наблюдались рядом авторов (Шабад, 1967, Грицюте, 1975) при моделировании экспериментальных опухолей, развивающихся под воздействием канцерогенных препаратов или радиационных факторов.

Как известно, параметры радиационного поражения Алтайского края в результате деятельности Семипалатинского полигона – это большие накопленные дозы при невысокой интенсивности облучения в сочетании с техногенными загрязнениями региона. В связи с этим анализ биологических последствий суммы указанных антропогенных факторов, среди которых радиационному принадлежит, по-видимому, лидирующая роль, является несомненно актуальным.

Анализ литературы показывает, что в районах с повышенным уровнем ионизирующих излучений имеет место поражение многих элементов биоценоза при относительно малых мощностях доз хронического облучения. Повышенная радиоустойчивость хронически облучаемых популяций говорит о возможности существования их радиоадаптации. Вместе с тем, повышенный генетический груз, наблюдаемый в хронически облучаемых популяциях, свидетельствует о том, что действие радиации в течение нескольких десятков поколений способствует специфическому приспособлению организмов к мутагенному действию этого экологического фактора. Однако, по мнению ряда авторов, приспособленности может и не вырабатываться в короткие периоды после ударных воздействий (Абрамов, Шевченко, 1987).

Мы оценили ряд биологических признаков, характеризующих состояние индивидуумов из природных популяций мышевидных грызунов. Специфика проведенного мониторинга заключается в комплексной оценке материала, взятого из трех районов сравнения. Эти районы различаются по уровню реализованных доз облучения, радиационному фону, эффективным дозам других антропогенных факторов, степени их сочетанности с потенциальными мутагенами и/или канцерогенами промышленных, геохимических и агрохимических загрязнений. Этот вопрос нами уже обсуждался ранее (Каракин и др., 1993).

Среди исследованных признаков – число эритроцитов и лейкоцитов крови, общий уровень иммуноглобулинов у здоровых животных, важный для сравнительного анализа их иммунологического статуса, хромосомные аберрации в соматических тканях, патологические изменения внутренних органов, включая злокачественные новообразования. Оценка столь широкого комплекса признаков с привлечением видов, обитающих на данных территориях, предложена впервые.

Обращают на себя внимание данные по снижению количества лейкоцитов у мышей сравниваемых районов Алтайского края. Известно, что фагоцитарная активность, позволяющая играть лейкоцитам ведущую роль в клеточном и гуморальном иммунитете, обмене гистамина, антитоксических, антимикробных, антителообразующих и других важнейших компонентах иммунологических реакций, в пораженных районах явно ослаблена.

Еще более интересен выявленный нами факт лейкопении у животных с воспалительными процессами, затронувший представителей обоих видов в Угловском районе. Вялая реакция лейкоцитов на воспалительные процессы, по-видимому, отражает неблагоприятную для животных данных видов генетически закрепленную реакцию, сформировавшуюся в течение многих поколений на пораженной территории.

Лейкопения, как известно, наблюдается при вирусных инфекциях, некоторых хронических бактериальных инфекциях, сепсисе, хроническом гепатите, аутоиммунных заболеваниях. Особенно резкая лейкопения наблюдается при апластической анемии и после лучевых воздействий.

Однако вопрос, как реагирует лейкоцитарная система на постоянное облучение минимальными дозами на протяжении многих поколений совершенно не изучен. Поэтому мы придаем важное значение результатам, показывающим уменьшение содержания лейкоцитов у грызунов в районах с повышенным антропогенным загрязнением.

При сравнительном исследовании иммунологического статуса животных обнаружено достоверное снижение уровня IgG у домовых мышей Локтевского района. Хорошо известно, что снижение количества IgG является показателем иммунодепрессии у мышей, испытывающих различные агрессивные средовые воздействия (в том числе загрязнение радионуклидами, химическими веществами и др.). Иммунодепрессия обусловливает ослабление устойчивости животных к инфекционным заболеваниям различной этиологии.

Нет основания полагать, что замкнутая популяция мышевидных грызунов в отношении последствий воздействия испытаний ядерных устройств на полигоне будет принципиально отличаться от исследованных аналогичных характеристик человека, различия могут быть лишь в коэффициентах. Конечно, для грызунов характерна более высокая частота генераций, если за начальное время сравнения принять 1949 год (около 100 поколений грызунов).

Было бы также крайне интересно провести эксперимент с использованием контрастных по изучаемым признакам линий мышей, изучить генотоксические и онкологические последствия прямых радиационных воздействий различных доз реального внешнего и внутреннего облучения (от 3 до 200 бэр) у исходных линий, а также у потомков первого и второго поколений реципрокных гибридов облученных и необлученных родителей.

Проведение такого эксперимента было бы весьма важным, поскольку данные проведенного мониторинга указывают на возможность существования сформированного генетического компонента для предрасположенности к хромосомным нарушениям, аномалиям состава крови, онкологическим и другим патологиям определенного типа у грызунов в Угловском, Тюменцевском и Локтевском районах.

Выявленные нами онкологические патологии внутренних органов наблюдались ранее при моделировании экспериментальных опухолей, развивающихся под воздействием онкогенных препаратов или радиационных факторов. Следует отметить, что Тюменцевский район, являясь средним по степени радиационной зараженности, лидером по выявленным нами паразитозам и, по-видимому, сопоставимым с Локтевским районом по агрохимической нагрузке, выявил значительно более широкий спектр онкологических патологий по сравнению с другими районами (табл. 4). Интересно также отметить, что Угловский район, являясь радиационно наиболее пораженным среди сравниваемых районов, имел более высокие частоты опухолей в почках и легких. По-видимому, компоненты взаимодействия животных со средой обитания (пища и воздух) могут приводить к развитию указанных патологий, хотя для точного доказательства высказанных соображений требуется проведение модельных экспериментов.

На наш взгляд, наиболее адекватным компонентом радиационного мониторинга обследованных территорий явился анализ хромосомных аберраций в соматических клетках животных, относительные частоты которых, как оказалось, прямо коррелируют с уровнем радиоактивной пораженности. Это заключение хорошо согласуется с данными классической радиационной генетики (Дубинин, 1968).

Однако мы полагаем, что чем шире набор биологических показателей, с помощью которых оцениваются эффекты антропогенных нагрузок на те или иные территории, тем более рациональные мероприятия по их нейтрализации можно предпринять. Цитогенетический тест – наиболее информативный показатель радиационной нагрузки. Далее по эффективности, в соответствии с полученными нами объективными данными, следуют показатели крови, затем общие патологии внутренних органов, включая злокачественные новообразования. Проведенный комплексный мониторинг позволил, во-первых, ранжировать исследованные биологические признаки по их информативности, а во-вторых, позволил поставить ряд новых задач мониторинга, среди которых наиболее привлекательной представляется оценка полиморфизма фрагментов наиболее часто мутирующих сигнальных генов с помощью полимеразной цепной реакции.

Таким образом, нами разработана и предложена комплексная биологическая тест-система для оценки антропогенных воздействий с использованием природных популяций мышевидных грызунов, а также зафиксирована базовая шкала биологических характеристик 90-го поколения грызунов после 1949 г., важная для обследованных территорий.

Литература

1. Абрамов В.И., Шевченко В.А. Генетические последствия хронического действия ионизирующих излучений на популяции // Радиационный мутагенез и его роль в эволюции и селекции. – М.: Наука, 1987. – С. 83–109.

2. Грицюте Л.А. Экспериментальные опухоли легких. – М.: Изд. Медицина, 1975. – 167 с.

3. Дубинин Н.П. Радиация и наследственность // Генетика и патология. – М.: Медицина, 1968. – С. 117-166.

4. Каракин Е.И., Семенова Л.А., Паломодова Л.А., Паймуратова Т.В., Слынько Н.М., Гулевич В.В., Леонова И.Н., Осадчук А.В., Луценко Н.Д., Кутузова Т.В., Роничевская Г.М., Зверева Л.Н., Николин В.П., Попова Н.А., Ильницкая С.И., Серова И.А., Чересиз С.В., Бочкарев М.Н. Генетический мониторинг-92 природных популяций мышевидных грызунов Алтайского края // Генетические эффекты антропогенных факторов среды. – Новосибирск: ИЦиГ СО РАН, 1993. – С. 80-91.

5. Киселев В.И., Лоборев В.М., Шойхет Я.Н. Проблемы количественной оценки воздействия Семипалатинского полигона на население Алтайского края // Вестник научной программы “Семипалатинский полигон – Алтай”. – 1994. – 1. – С. 5-9.

6. Лабораторные животные. – М.: Наука, 1983. – 417 с.

7. Сухоруков Ф.В., Гавшин В.М., Маликова И.Н., Ковалев С.И. Радиоцезий и стронций-90 в компонентах окружающей среды Алтайского региона // Радиоактивность и радиоактивные элементы в среде обитания человека. – Томск, 1995. – С. 235-238.

8. Шабад Л.М. Предрак в экспериментально-морфологическом аспекте. – М.: Медицина, 1967. – 384 с.

Е.И.Каракин, д.б.н.,
Институт цитологии и генетики СО РАН

Т.А.Дупал, к.б.н.,
Институт систематики и экологии животных СО РАН

М.Н.Бочкарев, к.б.н.,
Институт цитологии и генетики СО РАН

В.В.Иванов, д.м.н.,
Институт гигиены Минздрава РФ