Laboratory of Developmental Epigenetics

DISTRIBUTION OF MODIFICATIONS ALONG Xi, DETECTED AT THE CYTOLOGICAL LEVEL
Chromatin modifications are differently distributed along Xi. At the cytological level, the entire Xi appears as late-replicated. On Xa late replication is detected in the G-positive bands and heterochromatic regions [4] (Fig. 2a). Based on the analysis of immunofluorescent chromosome painting, it was shown that hypoacetylation of H4 and hypomethylation of H3K4 were uniform along the entire Xi [4] (Figs. 2b, 2c). The Xist RNA was discretely localized on metaphase chromosome in the gene-enriched regions corresponding to the G-negative bands [28]. In the same regions, triMeH3K27 [29, 30] and uH2A [13] were detected (Fig. 2d). The distribution of the PRC2 Polycomb proteins, involved in the histone H3 methylation in early embryogenesis (Eea and Enx1), also coincides with the Xist RNA distribution [29] (Fig. 2e). It was demonstrated that human Xi chromosome regions corresponding to the G-positive bands contained a number of modifications, typical of heterochromatin chromosome regions, including HP1 heterochromatin protein, triMeH3K9, and triMeH3K20. It should be noted that these modification do not overlap with those typical of the XIST RNA-binding bands. Thus, Xi was shown to contain the two main types of heterochromatin, one of which was characterized by the presence of triMeH3K9, triMeH3K20 and the HP1 protein, while another type contained triMeH3K27, XIST RNA, and XIST-associated factors [30].
The X chromosome of the common vole Microtus rossiaemeridionalis contains a heterochromatic block mostly composed of the MS3 and MS4 repeats of 3356 and 4088 bp, respectively, containing transposable element fragments [31]. This heterochromatin block on Xi and Xa is hypomethylated at H3K4, hypoacetylated at H4, does not bind Xist RNA, and is not stained with the antibodies against triMeH3K27 and uH2A. However, it is intensely stained with the antibodies against HP1 and triMeH3K9 (Figs. 2b—2g). Note that immunostaining for HP1 and triMeH3K9 on heterochromatin blocks is more intenve compared to the G-positive Xi bands. Heterochromatin blocks both on Xa and Xi are replicated in late S phase (Fig. 2a). It is suggested that in M. rossiaemeridionalis block of repeated sequence on X-chromosome forms the third heterochromatin type, the establishement and maintenance of which occurs independently from the inactivation process.

В результате процесса инактивации происходят модификации хроматина инактивируемой Х-хромосомы, которые позволяют репрессировать транскрипцию и поддерживать неактивное состояние генов в ряду клеточных поколений. При исследовании процесса инактивации Х-хромосомы планируется проследить динамику модификаций хроматина инактивируемой Х-хромосомы в ходе эмбриогенеза, выявить отличия характеристик хроматина в линиях трофобластных стволовых клеток, стволовых клетках экстраэмбриональной эндодермы и соматических клетках, а так же изучить зависимость транскрипционного статуса генов от модификаций хроматина и механизмы Polycomb- и HP1-зависимой репрессии генов. Актуальными, на наш взгляд, могут быть следующие направления исследований: биохимический анализ Polycomb-белков, принимающих участие в прцессе инактивации, исследование роли отдельных субъединиц Polycomb-белков и белков HP1 в процессе модификации хроматина неактивной Х-хромосомы, поиск у млекопитающих элементов ДНК, ответственных за связывание с Polycomb-белками; исследование динамики модификаций, связанных с HP1 белками в ходе эмбриогенеза, и выявление особенностей участия HP1 белков в инактивации Х-хромосомы и формировании конститутивного гетерохроматина, изучение роли метилирования ДНК в процессе инактивации Х-хромосомы.
Исследования хроматина, проводимые на полевках, позволят выявить консервативные и видоспецифицеские особенности хроматина неактивной Х-хромосомы. Следует отметить, что модификации хроматина неактивной Х-хромосомы на препаратах метафазных хромосом у полевок наблюдаются более четко по сравнению с другими объектами. Кроме того, наличие на Х-хромосомах полевок блоков конститутивного гетерохроматина позволит одновременно наблюдать за изменением его транскрипционного статуса и процессом его формирования в эмбриогенезе. Установлено, что на неактивной Х-хромосоме формируется два типа гетерохроматина, один из которых характеризуется наличием в структуре триметилированного H3 по лизину K9, K20 и белка НР1, другой – РНК Xist, триметилированного Н3К27, и убиквитинированного H2A (Chadwick, Willard, 2004, 2006, Шевченко и др., 2006). В настоящее время интерес представляет более детальное исследование этих двух типов неактивного хроматина на цитогенетическом уровне с помощью метода иммунофлуоресценции и на молекулярном уровне с помощью иммунопреципитации хроматина. При исследовании методом иммунопреципитации районов хроматина, содержащих гены, следует более детально проанализировать, каким образом распределены модификации в экзонах, интронах, регуляторных областях и межгенных промежутках. Также следует обратить внимание на характеристики хроматина генов, избегающих инактивации на неактивной Х-хромосоме, и попытаться охарактеризовать границу между транскрипционно активным и неактивным хроматином.

Одно из основных свойств неактивного хроматина, которое остается практически неизученным, – его поздняя репликация в S-фазе клеточного цикла (Gomez, Brockdorff, 2003). Различия во времени репликации могут быть связаны с изменением количества ориджинов репликации, изменением скорости движения репликационной вилки, изменением времени активации ориджинов. Все эти факторы не исключают друг друга, и на данный момент широко обсуждается вклад каждого из них в картину репликации. Начальным этапом для исследований в этом направлении могло бы стать картирование ориджинов репликации Х-сцепленных генов и анализ времени репликации генов, подвергающихся и избегающих инактивации. Эти данные сформируют хорошую базу для дальнейших исследований, направленных на понимание причин и механизмов поздней репликации. В данной работе планируется исследование инициации репликации в центре инактивации Х-хромосомы обыкновенных полевок рода Microtus. Данный район включает гены, участвующие в процессе инактивации (Xist/Tsix), имеющие разный транскрипционный статус в Х-хромосомах самок и самцов. На начальном этапе будут выявлены и сопоставлены зоны инициации репликации в центре инактивации Х-хромосомы в клетках самцов и самок близкородственных видов полевок рода Microtus. В исследованиях будут использованы культуры трофобластных стволовых клеток, соматических клеток (фибробластов) и клеток экстраэмбриональной эндодермы. Наличие в данном районе хроматина с разной транскрипционной активностью позволит изучить влияние модификаций хроматина на детерминацию ориджинов и время репликации.