Разработчики
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН), Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук» (ИЦиГ СО РАН)
Авторы
Шатунова Е.А., Королев М. А., Мещанинова М. И., Воробьева М. А.
Краткая характеристика
Предложены новые ДНК-аптамеры: DK1, DK2, DK4, DK4-41t, DK2-48t, представляющие собой олигодезоксирибонуклеотиды с числом нуклеотидных звеньев от 41 до 71, имеющие нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, обладающие способностью высокоаффинно связывать белок Dickkopf-1 человека, в том числе в образцах сыворотки крови пациентов с иммуновоспалительным ревматическим заболеванием.
Вторичные структуры ДНК-аптамеров DK1, DK2, DK4, DK4-4U, DK2-48t по данным компьютерного моделирования, проведенного на основе алгоритма минимизации свободной энергии с помощью программного пакета mfold version 2.3.
Кривые связывания с белком DKK-1 для ДНК-аптамеров DK1, DK2, DK4, DK4-41t, DK2-48t. Полученные данные свидетельствуют о том, что аптамеры DK1, DK2, DK4, DK4-4U, DK2-48t связываются с белком DKK-1 с высоким сродством.
Усредненные по двум параллельным измерениям значения уровня DKK-1 в каждом из исследованных образцов сыворотки. Из полученных значений видно, что использование иммобилизованного в лунках планшета аптамера DK4 позволяет количественно определить уровни DKK-1 в образцах сыворотки крови от пациентов с анкилозирующим спондилитом колориметрическим методом.
Области возможного использования
Биотехнология и медицина.
Степень готовности разработки к практическому применению
Разработка готова к практическому применению.
Возможный технический и (или) экономический эффект
Изобретение обеспечивает повышение аффинности ДНК-аптамеров, специфично и прочно связывающихся с белком Dickkopf-1 человека, а также расширение ассортимента ДНК-аптамеров.
Сравнительные характеристики с известными разработками
Известен способ количественного определения уровней Dkk-1 в сыворотке крови путем иммуноферментного анализа [1; 2]. К недостаткам данного способа относятся достаточно высокая стоимость анализа и проблемы с воспроизводимостью результатов, полученных с использованием разных партий антител и диагностических наборов, что особенно значимо для длительных многолетних исследований. Именно поэтому более выгодной альтернативой антителам могут стать аптамеры к белку DKK-1. Наиболее близким к заявляемому ДНК-аптамеру — прототипом, является аптамер TD10 к белку DKK-1 человека, представляющий собой 39-звенный ДНК-аптамер, имеющий молекулярную массу 12.1 кДа, с константой диссоциации 7.7 нМ [18]. Данный аптамер обладает специфическим сродством к белку-мишени и был опробован в качестве компонента тест-систем для детекции DKK-1 в крови больных гепатоцеллюлярной карциномой.
Полученные аптамеры обладали следующими характеристиками:
— формировали прочные комплексы с рекомбинантным белком DKK-1 человека;
— не связывались с мажорным белком сыворотки крови человека — человеческим сывороточным альбумином.
Определяющими отличиями предлагаемых ДНК-аптамеров от прототипа являются:
— уникальные нуклеотидные последовательности, негомологичные нуклеотидной последовательности прототипа, аптамера TD10;
— более высокая аффинность к белку-мишени по сравнению с прототипом TD10 при анализе аффинности в одинаковых условиях (оценена по значениям констант диссоциации комплекса аптамер-мишень).
- Seror R., Boudaoud S., Pavy S., Nocturne G., Schaeverbeke Т., Saraux A., Chanson P., Gottenberg J.-E., Devauchelle-Pensec V., Tobon G.J., Mariette X., Miceli-Richard C. Increased Dickkopf-1 in recent-onset rheumatoid arthritis is a new biomarker of structural severity. Data from the ESPOIR cohort. Scientific Reports. 2016, V. 6, P. 18421. doi: 10.1038/srep 18421.
- Y. Yuliasih. The increasing level of DKK-1 as a new bone formation factor in patients with early spondyloarthritis. Autoimmune Diseases. 2023, V. 2023, P. 5543234. doi: 10.1155/2023/5543234.
Патентная защита разработки
Патент на изобретение №2814580. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений 01.03.2024. Номер и дата поступления заявки: 2023120087 28.07.2023, Бюл. №7.