Патентообладатели

ИЦиГ СО РАН

Авторы
Разуваева А.В., Ульянова Е.Г.

Краткая характеристика

Предложен способ идентификации видов хищных клещей рода Amblyseius. Выделяют ДНК из предварительно собранного биологического материала, проводят ПЦР участка рибосомальной ДНК с использованием специфических праймеров. Проводят рестрикционный анализ ампликона и визуализацию продуктов рестрикции в агарозном геле. Для рестрикционного анализа используют эндонуклеазы рестрикции AccB1I, AccB7I, DseDI и HaeIII. Наличие фрагментов ДНК длиной 510 и 109 п.н. при обработке рестриктазой AccB1I указывает на принадлежность к виду A. cucumeris, наличие фрагментов ДНК длиной 514 и 93 п.н. при обработке рестриктазой AccB7I указывает на принадлежность к виду A. swirskii, наличие фрагментов ДНК длиной 451 и 171 п.н. после рестрикционного анализа ферментом DseDI указывает на принадлежность к виду A. montdorensis, а наличие фрагментов ДНК длиной 496 и 120 п.н. после обработки рестриктазой HaeIII — на принадлежность к виду A. califomicus, в то время как другие рестриктазы не имеют сайты рестрикции. В качестве матрицы в реакции ПЦР используют целого клеща на любой стадии жизненного цикла.

Электрофореграмма продуктов рестрикции ПЦР-продукта, полученного при амплификации фрагмента рДНК с помощью рестриктаз AccB1I , AccB7I и HaeIII, где: 1) A.cucumeris, 2) A.swirskii, 3) A.montdorensis, 4) A.californicus. Μ — маркер молекулярного веса ДНК Step 100 (Биолабмикс, Новосибирск).

Электрофореграмма продуктов рестрикции ПЦР-продукта, полученного при амплификации фрагмента рДНК с помощью рестриктазы DseDI 1) A.cucumeris, 2) A.swirskii, 3) A.montdorensis, 4) A.californicus. Μ — маркер молекулярного веса ДНК Step 100 (Биолабмикс, Новосибирск).

Области возможного использования

Изобретение относится к области биохимии, а именно к молекулярно-генетическим методам идентификации организмов – клещей рода Amblyseius, и может быть использовано для правильной диагностики выращиваемых клещей

Степень готовности разработки к практическому применению

Разработка готова к практическому применению.

Возможный технический и (или) экономический эффект

Предлагаемый способ дифференциации хищных клещей является высокочувствительным, хорошо воспроизводимым и экономичным. В зависимости от способа выделения ДНК из биологических образцов, анализ занимает от 4,5 до 6 часов. Анализ можно проводить в лабораториях, имеющих ДНК-амплификатор, центрифугу, термостат, камеру для электрофореза и сопутствующие реактивы и расходные материалы.

Сравнительные характеристики с известными разработками

Наиболее близким к заявляемому способу является способ дифференциации коммерчески значимых клещей рода Amblyseius на основе рестрикционного анализа, включающий выделение ДНК из предварительно собранного биологического материала, последующее проведение амплификации участка митохондриальной ДНК при помощи ПЦР, рестрикционного анализа ампликона, проведение электрофореза в агарозном геле, при этом, при проведении ПЦР используют праймеры: прямой ITS1 GAATATGAGCCGGAATAGTAGGA, обратный ITS4 ATGTGTTGAAGTTACGGTCA, а для рестрикционного анализа используют рестриктазы AccB1I, AspLE, SspI, причем наличие фрагментов ДНК длиной 509 и 129 п.н. при обработке рестриктазой AccB1I указывает на принадлежность к виду A. cucumeris, наличие фрагментов ДНК длиной 381 и 260 п.н. при обработке рестриктазой Ssp I указывает на принадлежность к виду A. barkeri, а наличие фрагментов ДНК длиной 405 и 227 п.н. при обработке рестриктазой AspLE указывает на принадлежность к виду A. swirskii, в то время как две другие рестриктазы не имеют сайты рестрикции (Патент RU 2631933 C1, опубл. 28.09.2017).

Недостатками вышеописанного способа являются ограниченные функциональные возможности, поскольку он обеспечивает идентификацию только трех видов хищных клещей рода Amblyseius, а именно Amblyseius swirskii, A. cucumeris и A. barkeri при помощи метода полиморфизма длины рестрикционного фрагмента после ПЦР (ПЦР-ПДРФ) с использованием рестриктаз AccB1I, AspLE и SspI.

В предлагаемом способе на этапе рестрикционного анализа применяют экспериментально подобранные эндонуклеазы рестрикции – AccB1I, AccB7I, DseDI и HaeIII, что позволяет идентифицировать 4 хищных вида клеща рода Amblyseius: Amblyseius swirskii, A. cucumeris, A. montdorensis и A. californicus.

Патентная защита разработки

Патент № 2804853 , опубл. 06.10.2023 , Бюл. № 28.